Fiziksel yöntemler, DNA'nin dogrudan dogruya enjeksiyonu, lipozom formülasyonlari ve balistik gen enjeksiyonu yöntemlerini içerir. Dogrudan DNA enjeksiyonunda ilgili gen DNA'sini tasiyan plazmit, dogrudan dogruya, örnegin kas içine, enjekte edilir. Yöntem basit olmasina karsin kisitli bir uygulama alani vardir.

Lipozomlar, lipidlerden olusan moleküllerdir. DNA'yi içlerine alma mekanizmalarina göre iki guruba ayrilirlar: Katyonik lipozomlar ve pH-duyarli lipozomlar. Birinci gurup lipozomlar arti yüklü olduklarindan, eksi yüklü olan DNA ile dayanikli bir kompleks olustururlar. Ikinci gurup lipozomlarsa negatif yüklü olduklarindan DNA ile bir kompleks olusturmaz, ama içlerinde tasirlar. Parça bombardimani ya da gen tabancasi olarak da adlandirilan balistik DNA enjeksiyonu, ilk olarak bitkilere gen nakli yapmak amaciyla gelistirilmistir. Bu ilk uygulamalarindan sonra, bazi degisiklikler yapilarak memeli hücrelerine gen nakli amaciyla kullanilmaya baslanmistir. Bu yöntemde, genellikle altin ya da tungstenden olusan 1-3 mm boyutunda mikroparçaciklar, tedavi edici geni tasiyan plazmit DNA'si ile kaplanir, sonra da bu parçaciklara hiz kazandirilarak, hücre zarini delip, içeri girmeleri saglanir.

Basit olmalarina karsin fiziksel yöntemler verimsizdir; ayrica, yabanci genler, sadece belirli bir süre fonksiyonal kalabilmektedirler. Bu nedenle arastirmacilarin çogu, genellikle virüs kökenli vektörlere yönelmislerdir. "Vektör" kelimesinin bir anlami da "tasiyici"dir. Benzer sekilde, gen terapisinde genleri hücrelere tasima amaciyla kullanilan ve genetik olarak zararsiz hale getirilmis virüslere de vektör denir.

Günümüzde yapilan arastirmalarda, virüslerin hastaliga yol açan gen parçalarinin yerine, hastalari iyilestirme amaciyla rekombinant genler yerlestirilmektedir. Bu amaçla degistirilmis hücreler kullanilmaktadir. Bu hücrelere tedavi edici geni tasiyan bir genetik yapi sokuldugunda, tedavi edici geni içinde tasiyan virüsler elde edilir. Bu sekilde degistirilmis virüsler hücreye girmek için kendi yöntemlerini kullanirlar ve genomlarinin ekspresyonu sonucu, genin kodladigi protein üretilmeye baslanir. Öte yandan, virüsün kendisini çogaltmak için ihtiyaç duydugu genler, tedavi edici genlerle degistirilmis oldugundan, virüs çogalip hücreyi patlatamaz. Bunu yerine, hücrede virüsün tasidigi hastaligi düzeltici genin ekspresyonu olur, genin kodladigi protein (yani ilaç) üretilir ve genetik bozukluk nedeniyle üretilemeyen proteinin yerini alir.
En çok kullanilan viral vektörler, retrovirüsler, adenovirüsler, herpesvirüsler (uçuk virüsü) ve adeno-iliskili virüslerdir. Ama her vektörün kendine özgü dezavantajlari vardir: Bölünmeyen hücreleri enfekte edememek (retrovirüs), olumsuz immünolojik etkiler (adenovirüs), sitotoksik etkiler (herpesvirüs) ve kisitli yabanci genetik materyal tasiyabilme kapasitesi (adeno-iliskili virüs). Ideal bir vektörde aranan özellikler yüksek titraj, kolay tasarlanabilme, integre olabilme yetenegi ve gen transkripsiyonunun kontrol edilebiliyor olmasinin yaninda, imünolojik etkilerin olmamasidir.

Gen Aktarim Teknikleri

Viral Vektorler:                                

1. Retroviral vektörler                     
2. Adenoviral vektörler                  
3. Adeno-asociated virus                 
4. Herpes Simpleks Virus Tip-1         
5. Polio Virus                                 
6. Ördek Hepatit Virusu                  
7. Parvovirus                                 
8. Sendaivirus                              
9. Sindbis virus

Fiziksel ve Kimyasal Yöntemler

1. Transferin-reseptörü araciligi ile    
2. Asiaglikoprotein DNA konjugatlari
3. Lipofection                                 
4. Direk aktarim
5. Kalsium fosfat çöktürmesi ile       
6. Diethilaminoetil dekstran
7. Elektroporasyon                         
8. Sonikasyon
9. Kazima yöntemiyle                    
10. Polibrene/dimetilsulfoksid
11. Jet injeksiyon                           
12. Partikül bombardimani

Genlerin vücuda yerlestirilmesi yöntemleri

Genleri vücuda yerlestirmenin çesitli yollari vardir. Genel olarak, gen tedavisi iki esas bölümde siniflandirilabilir.

1. ex vivo yaklasim: Bu yaklasimda hücreler vücuttan alinir; in vitro kosullarda gen transferi yapilir. Tekrar vücuda geri verilir. Bu yaklasimin avantajlari sunlardir:

a. Gen aktarimi genel olarak yüksektir.

b. Eger vektör seçilebilir marker gen tasiyorsa; gen aktarilan hücreler  zenginlestirilebilir.

c. Re-implantasyon öncesinde etkinlik kontrol edilebilir.

2. in vivo yaklasim: Vücuttaki hücrelere genlerin direk transferidir. Bu aktarim, in vitro kosullarda gerçeklestirilir ve hücreler aliciya tekrar geri verilerek yapildigi gibi alicinin dokusuna in situ direk aktarim seklinde de yapilabilir. Ayrica henüz kullanilmamakta ise de bir vektör araciligi ile de kan yoluyla aktarim gerçeklestirilebilir. Bu vektörler plasmidin konakçi hücrede takibini saglayacak sekilde flöresans ile isaretlenebilir. En önemli sorun spesifiklik ve duragan gen transferinin düsük etkinligidir. Bu klinikde arka arkaya tedavi islemlerini gerektirmektedir.

Gen tedavisinde antisens oligonükleotid kullanimi

Antisens oligonükleotidler, küçük sentetik nükleotid dizileri olup; bunlar spesifik DNA veya RNA dizilerine komplementerdirler. Eksojen oligonükleotidler nükleik asit baglayici reseptörler araciligi ile hücre içerisine alinirlar. Terapötik ürün olarak hazirlanmalarinda baslica sorun hücre içerisine tasinabilmeleridir. Oligonükleotidlerin gen tedavisinde kullanilmasi ‘eger belirli bir gen bir hastaliktan sorumlu ise; bunun çalistirilmamasi klinik anormalligin düzelmesini saglayabilir’ prensibinden yola çikarak tasarlanmaya baslanmistir. Antisens oligonükleotidler genin çevrilmesini durdurarak hastaliga neden olan genlerin ekspresyonunu engelleyen yapilardir. Bu yapilar onkogenleri kontrol altina alabilmekte ve virüs DNA’sinin çevrilmesini engelleyebilmektedirler.
 
Bir çok ilaçda amaç defektif veya istenmeyen proteinin sentez edildikten sonra fonksionuna engel olmaktir. Antisens teknolojide amaç protein sentezinin spesifik kisa tek sarmal DNA veya RNA dizileri kullanilarak önlenmesidir.

Bu önleme, protein sentezinin:

1) Genomik DNA'nin mRNA'ya transkripsiyonunda

2) mRNA'nin proteine translasyonu sirasinda mümkün olabilir.

Sitoplazmik mRNA, DNA 'ya oranla daha kolay bir hedef gibi görünmektedir. Bu yaklasimla, c-myc geni/lenfoma hücre dizileri bcr-abl/ Kronik Myelositer Lösemide blast hücrelerinde denemeler yapilmistir. In vitro çalismalarda, anormal mRNA olusturan Burkitt lenfoma hücre dizilerinin çogalmasi antisens oligonükleotidlerle durdurulmustur. Antisens oligonükleotidler, hücre dizilerinin kanserlesmesini veya metastatik potansiyellerini azaltir.

Anti-sens olarak gelistirilen ve AIDS'li hastalarda olusan sitomegalovirus retinitini tedavi edecek olan ilaç intra vitreal enjeksiyonla 1998 yilinda insanda kullanilmaya baslanmistir.

Oligonukleotid ile gen fonksiyonu

Amaç DNA'da var olan hatanin, yapisal DNA hatasina dönüstürülerek, tamir mekanizmasinin taniyabilmesini saglamaktir. 20 bazlik bir oligonükleotide baglanan bir alkile edici ajan, ikili helikse yapisir. Tek iplikçikli oligonükleotid hedef DNA'da kendisine uyan bölgeye yapisir. replikasyon sirasinda, hücre tamir mekanizmalari devreye girer ve düzeltmeyi yapar.

Bu metod ile obesite, b-adrenerjik reseptör mutasyonu, Hb S ve kistik fibrozisin gen tedavisi çalismalari yapilmaktadir.

Genetik immünomodülasyon:

Genetik immünomodülasyon, gen tedavisinde sitokinleri kodlayan genlerin vektörler araciligi ile aktarilmasini kapsamaktadir. Sitokinlerin, klinik olarak tümör büyümesi üzerine önemli etkisi vardir. Immün sistemde yapilacak modifikasyonla, konakçinin antitümör immün yaniti gelistirilebilir. Tümör infiltre eden lenfositlere TNF geni aktarilmasi modeli bunun bir örnegidir.

Ilaç hedeflemesi:

Gen tedavisinde kullanilan vektörlerin spesifik olarak hastalikli hücrelerde eksprese olurken normal hücrelerde bunun olusmamasi temel amaçtir.

Degisik doku ve hücrelerde gen tedavi yaklasimlari asagida özetlenmistir.

Kemik iligi: Kemik iligi transplantasyonu için gerekli olan teknik islemlerin ve tedavinin gelistirilmesi ile hematopoetik sistem gen tedavisi için uygun bir aday doku olmustur. Pluripotent hematopoetik kök hücre, kemik iligi hücrelerinin %0.01-0.1'i kadardir. Pluripotent olmasi ve kendiliginden yenilenmesi, ideal bir hedef doku halini almasini saglar. Ex vivo tedavinin en güzel örnegidir. Bir kaç hücreye bir gen aktarimi olmasi halinde dahi, aktarilan genin sürekli varligi mümkün olacaktir. Yüksek sinif hayvanlarda, bu hücrelerin enfekte edilmesi güçtür. Kemik iligindeki bag dokusu hücrelerinin etkin transferde önemli rolü oldugu gösterilmistir. Kemik iliginin gen tedavisi için ilk hedef doku olmasinin nedenleri söyle siralanabilir.

1- Kemik iligi hücreleri kolayca elde edilebilir.

2- In vitro olarak çalisilabilirler.

3- Bireye tekrar reinfüze edilebilirler.

4- Infüzyon sonrasi organizmada çogalarak, farklilasmaya ugrarlar. Böylece organizmada yeni bir hücre popülasyonu olusturulabilir.

Kas: Çok sayida hedef hücreye gereksinim oldugundan; yüksek etkinlikte gen transferine ihtiyaç vardir. Retrovirusla infekte edilen primer myoblastlarin hayvan kasi içine zerk edilmesi ile alti aylik bir sürenin üzerinde gen ekspresyonu saglanmistir. En önemli dezavantaji, myoblastlarin zerk edildigi bölgede kalmasidir. Adenovirus vektörünün intravenöz olarak siçana verildikten sonra, etkin bir transduction hem kas fibrillerinde, hem de diger dokularda saglanmistir. Kas fibrillerinin in vivo direkt gen aktarim teknikleri için de kullanilabildigi gösterilmistir. plazmid DNA'nin iskelet ve kalp kaslarina direkt zerki ile duragan gen ekspresyonu saglanmistir. Bu zerk edilen plazmid DNA'si hücrede episomlar olarak bulunmaktadir. Bu prosedür, primatlarda çok etkin degildir.Insan büyüme hormonu genlerinin transferi ile de hayvanlarda bu hormonun düzeyleri üç ay sonra belirlenebilmistir.

Karaciger: Hepatositleri, kültür ortaminda manüple etmek oldukça güçtür. Çünkü bu hücreler kültür ortaminda çok az bölünmeye ugrarlar ve retroviral vektörlerle transduction etkinligi %20-25 gibi düsük düzeylerdedir. Her ne kadar in vivo olarak, hepatositler normal kosullarda bölünmezken, kismi hepatektomi, hepatositlerin hücre bölünmesini aktive eder. Bunu takiben retrovirus vektörünün in vivo perfüzyonu ile çok sayida hepatosit infekte edilebilir. Ancak etkinlik %1-2 civarindadir. Alfa-1- antitrypsin geni intraportal yolla adenoviral vektörle karacigere aktarilmissa da, genin ekspresyonu kisa sürmüstür.

Santral sinir sistemi: Yapisal ve fizyolojik kompleksligi nedeni ile SSS bozukluklarinda somatik gen tedavisi uygulanmasi beraberinde önemli sorunlari da getirmektedir. HSV-1 vektörleri hem in vivo, hem de ex vivo olarak sinir hücrelerinde aktarimda kullanilmistir.

Trakea epiteli: Bu hücrelerin organizma disina alinip, kültüre edilmesi ve sonra tekrar organizmaya implante edilmesindeki zorluklar nedeni ile in vivo aktarim kullanilmaktadir. Adenoviral vektörler ile trakea epiteline invivo gen aktarimi, siçanlarda basarilmistir.

Lenfosit: Adenosine Deaminaz enzim eksikliginde kullanilmistir. T hücrelerinin yasam sürelerinin sinirli olmasinin nedeni ile arka arkaya infüzyona ihtiyaç bulunmaktadir. AIDS ve kanser tedavisinde en uygun hedef doku olarak ortaya çikmaktadir.

Oküler hücreler: Vitröz içine adenovirus araciligi ile gen aktarimi yapilmistir.

Periferik kan progenitör hücreler: Kemik iligi yerine, periferik kandan izole edilen progenitör hücrelere gen transfer edilmesi ile uzun süreli hematopoesis saglanmistir.

Umbilikal ven epiteli: Umbilikal ven epiteline "Doku Faktör" transferi yapilmistir.

Gen Terapisinin Çözüm Bekleyen Sorunlari:

Ilk sorun, genlerin insana verilmesini saglayacak daha kolay ve etkili yöntemlerin bulunmasidir. Bir baska sorunsa, nakledilen genin hastanin genetik materyalinin hedeflenen bölgesine yerlesmesini saglamak ve böylece olasi bir kanser ya da baska bir düzensizlik riskini ortadan kaldirmaktir. Bu konudaki baska bir sorun da, yerlestirilen yeni genin vücudun normal fizyolojik sinyalleriyle etkin bir biçimde kontrolünün saglanmasidir. Örnegin insülin, dogru zamanda ve dogru miktarda üretilmedigi zaman, hastaya yarar yerine zarar getirecektir. Su ana kadar yapilan çalismalar sonrasi iyi sonuçlar alinabilmis fakat kalici tedavi çogu zaman basarili olamamistir. Bunun bir nedeni, vektörlerin tasidiklari genin uzun süreli ekspresyonuna izin vermeyisleri, digeriyse denemelerde etkinlikten çok güvenligin ön plana çikmasidir.

Su anki duruma göre, önümüzdeki yillarda gen tedavisindeki egilim, genleri istenilen hücrelere en etkin biçimde tasiyabilecek vektörlerin dizayn edilmesi yolunda olacak gibi görünüyor. O zaman, gen tedavisinin daha basarili sonuçlar verecegi söylenebilir.

Kaynak:
Dr. Ümit Yasar,  Farmakoloji AD

Yorum (0)

RSS yorumları

İsim

Başlık

Yorum

Gönder